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蛋白酶酶活测定方法及原理

方法

原理

福林酚法

福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等可使蛋白质及其水解产物呈上述反应,利用此原理测定蛋白酶酶活。

考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合,主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合,使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色,在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。

甲醛滴定法

蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸,再用甲醛固定氨基酸的氨基,用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸,从而测定其酶活。

DHT-酪蛋白法

5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化,得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白(DHT-酪蛋白)。以DHT-酪蛋白为底物,在蛋白酶作用下,水解生成DHT-肽,二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物,而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白,但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂,利用比色法可测定蛋白酶酶活。

DNA-溴乙锭荧光

分析法

溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时可使DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭(0.5μg/mL) DNA 混合时其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白使DNA 结合部位暴露出来溴乙锭重新插入DNA双链中荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。

X-光胶片法

酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上当待测酶液滴加到X-光胶片上时酶将X-光胶片上的明胶水解用水冲洗胶片即可看到胶片上明胶被酶水解的地方出现透明的圆圈。酶活性的高低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积以测定蛋白酶的活性。

 
 
 
 

 

 

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