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Q-PCR实验流程
 
一、 ①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。



二、 总RNA抽提
1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,吹打混匀,并吸至1.5ml RNase  free EP管中使细胞充分裂解,室温静置5min;
组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)
2)加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放,离心完毕,离心管的顺序也按顺序排好,与第一步的顺序一致)
3) 4℃下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNase  free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)
4)沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;
5)4℃下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀,应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀),去上清;
6)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干;沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解,过湿则乙醇残留。
7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。



三、去基因组
   使用RNase-free的DNase І(Promega),按以下体系配置反应液,37℃消化30min,65℃灭活10min。

RNA          
DNase І      
10 x buffer    
H2O(RNase free)
RNasin    
30
20
10
39.5
0.5
µl
µl
µl
µl
µl
总体积 100 µl
 
     然后按以下步骤操作:
1) 加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置5min,后14,000rpm,离心15min,取上清。
2) 加入等体积的氯仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清。
3)加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20℃静置15min;
4)4℃下,14,000g离心15min,收集RNA沉淀,去上清;
5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;
6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。




四、总RNA纯度和完整性检测                                                                                        
1)纯度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。
2)总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
 



五、逆转录
1. mRNA
1)      在RNase free的PCR管中配置下列溶液.

Total RNA       
H2O                       
 1.0
 
µg
µl
总体积 12 µl
 
 
 
 



2)      将上述溶液吹打均匀,置85℃保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷,  以防止RNA复性;
3)      在该PCR管中加入下列试剂(Promega)

oligo(dT)
Random primer              
10mM dNTP              
RNase inhibitor 
5 x buffer               
M-MLV          
0.5
0.5
2.0
0.5
4.0
0.5
µl
µl
µl
µl
µl
µl
总体积 8.0 µl
 
4)      将上述20μl反应溶液30℃保温10min;
5)      42℃保温50min;
6)      85℃保温10min;
7)      -20℃保存。
 
2. microRNA
使用茎环逆转录法,原理如下图:


 
1)  在去RNase的PCR管中配置以下溶液.

total RNA
X个miR逆转录引物
H2O                       

1.0
0.5*X
   
µg
µl
总体积 12.5 µl
 
 
 



 
2)将上述溶液混匀,85℃孵育5min,以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构;
3)  在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:

10mM dNTP (promega)              
RNase inhibitor (promega)
U6逆转录引物
5x buffer                
M-MLV (promega)   
2.0
0.5
0.5
4.0
0.5
µl
µl
µl
µl
µl
总体积 7.5 µl
 
4)  将3)溶液加入到1)溶液中,混匀后30℃保温10min;
5)  42℃孵育50min;
6)  85℃孵育10min灭活逆转录酶。
 

 六、定量PCR检测 

1.引物测试:
根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率,具体反应体系和反应条件如正式实验,每对引物需做模板水对照。
得到结果后,首先根据熔解曲线判断引物特异性,选择标准为:单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好,则应对比各引物的扩增曲线,优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。

2.确定上机内容后,首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。
1)一个样品的加样尽可能安排在同一行
2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上,则需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验不能分开两板
 

3.正式实验:
体系配制:
H2O                     4ul
SYBR Green PCR Master Mix       10ul  (TOYOBO)(使用前需振荡均匀)
上游引物                   0.5ul (10uM)
下游引物                   0.5ul 10uM
  总体积                   15ul
计算好实验中需用多少份体系,则按具体量配置。体系分装会有损失,一般多配0.5份--1份体系。
总的体系配好后,在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀,然后15ul每管分装至8连管中。
3.cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为1:20稀释,如遇到基因表达低的样品,则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕,盖好八连管盖,并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上,八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧,否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)
4.把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。
 

五.上机:
5.1  先开电脑,进入Windows 界面。接着打开PCR仪电源开关。
5.2  打开7500软件,选择“新建”,在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”(普通基因检测为“60”,MicroRNA检测为“65”)
5.3  打开样品架,放入八连管,关上样品架,并在软件上选择已放反应管的孔位,剔除无反应管的孔位。
5.4  点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名,命名为日期-上机时间-客户名字简写,如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。
5.5  点击Start键,开始运行程序。
5.6  程序运行完毕后,取出样品架上的八连管,按顺序关闭ABI PRISM 7500 SDS 软件、PCR仪电源开关。
5.7  在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称,分类保存好结果文件。
 
反应完成后,八连管应装到封口袋中,袋子上标记好文件名,客户的名字。(同一个客户的三次重复实验,则只需保存其中一次重复的反应管即可,其余可丢弃)
 

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