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1、基因组提取的主要试剂配制
1M Tris•Cl:121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中,用盐酸调pH值至8.0,定容至1L,高压灭菌。高压灭菌条件为1.034×105Pa,20min。
0.5M EDTA:EDTA 186.1g溶于800ml双蒸水中,用NaOH调pH值至8.0,定容至1L,高压灭菌。
10%SDS:SDS 100g溶于900ml双蒸水中,加热至68℃助溶,用HCl调pH值至7.2,定容至1000ml。
TE缓冲液:量取1ml 1M Tris•Cl(pH8.0),加上0.2ml 0.5M EDTA(pH8.0),定容至100ml,高压灭菌(终浓度10mM Tris•Cl(pH8.0),1mM EDTA(pH8.0))。
20×SET缓冲液:17.532gNaCl,12.114gTris碱,0.7444gEDTA,溶于50ml双蒸水中,用盐酸调pH值至8.0,定容至100ml,高压灭菌。(终浓度3M NaCl,1M Tris•Cl(pH 8.0),20mM EDTA(pH 8.0))。
蛋白酶K贮存液:10mg蛋白酶K溶于1ml的灭菌水中,于-20℃冰箱中贮存。
酚/氯仿/异戊醇:将其按24:23:1的比例混合放入棕色瓶中,于4℃贮存。
氯仿/异戊醇:将氯仿和异戊醇按规定的23:1混合,在棕色瓶中室温下贮存。

2、样品的采集及血液DNA提取
(1)样品的采集
将10ml的玻璃瓶及塑胶盖洗净灭菌,翅静脉抽取鹌鹑血液放入小瓶中(小瓶内事先加入肝素钠抗凝),注意在采集鹌鹑血的时候要尽量减少污染,动作应迅速。
(2)血液DNA提取步骤
⑴ 用灭菌的1ml枪头从小瓶中吸取500μl血样,放入1.5ml的EP管里。
⑵ 向管内加445μl 1×SET、25μl蛋白酶K(10mg/ml)、25μlSDS(10%),混匀。
⑶ 55℃空气浴振荡过夜。
⑷ 加500μl Tris饱合酚,上下颠倒10min。
⑸ 12000rpm离心10min,小心吸取上层水相于新的EP管中。注意不要触到、吸入中层蛋白质,其严重影响DNA的质量和后续反应。
⑹ 在吸得的上层水相中加入等体积酚、氯仿、异戊醇(24:23:1)混合液,上下颠倒10min。
⑺ 12000rpm离心10min,小心吸取上层水相于新的EP管中。
⑻ 加入等体积氯仿、异戊醇(23:1)混合液,上下颠倒10min。
⑼ 10000rpm离心10min,小心吸取上层水相于新的EP管中。
⑽ 加2倍体积无水乙醇(-20℃预冷),横向振荡3min。
⑾ 10000rpm离心10min,管底可见白色DNA沉淀。
⑿ 加1ml70%乙醇悬浮、洗涤DNA沉淀。
⒀ 8000rpm离心5min,倒掉乙醇,将EP管倒置在滤纸上直至管中的乙醇完全挥发。
⒁ 加100μl TE缓冲液,置55℃水浴中至DNA完全溶解。
⒂ 进行基因组DNA的浓度测定和质量检测。

3、基因组DNA的浓度测定和质量检测
使用安法玛西亚公司的分光光度计,测定DNA浓度。根据记录的OD260/280比值,估测DNA质量,一般OD260/280在1.6~1.8之间,可以满足实验要求。根据记录的OD260数值及稀释倍数,换算出待测DNA的浓度,并作相应的稀释,以50ng/μl分装,作为工作液4℃保存使用,DNA原液于-20℃保存。
 
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