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动物总RNA的提取
 
 
【实验目的】
 
通过本实验学习提取动物总RNA的方法。
 
 
【实验原理】
 
RNA是一类极易降解的分子,要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍,可溶解蛋白质,破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,失活RNA酶,所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后,除了RNA,还有DNA、蛋白质和细胞碎片,通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
 
 
【仪器、材料与试剂】
 
(1)仪器 
低温离心机
台式离心机
200℃以上烘箱
 制冰机
 琼脂糖凝胶电泳系统
 紫外线透射仪
 高压灭菌器
 液氮或-70℃冰箱
 匀浆器
 
(2)材料
 焦碳酸二乙酯(DEPC) 
 异硫氰酸胍
 醋酸钠(NaAc) 
 氯化锂(LiCl) 
 Tris.cl
饱和酚
 氯仿
 乙醇
 甲醛
 吗琳代丙烷磺酸(MOPS)
 乙二胺四乙酸(EDTA) 
 琼脂糖
 50mL离心管
陶瓷研钵
 剪刀
 一次性手套等
 (3)试剂
1.4mo1/L 异硫氰酸胍
2.2mo1/L NaAc(pH4.8) 
3.4mo1/L LiCl 
4.3mo1/L  NaAc(pH5.0) 
(以上试剂均用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)配制,然后高压灭菌)
5.0.1% DEPC水:200mL双蒸去离子水加0.2mLDEPC混匀
6.  5×电泳缓冲液 
吗琳代丙烷磺酸(MOPS)  0.1mo1/L
NaAc 40mmo1/L       
乙二胺四乙酸(EDTA)     5mmo1/L    
 7.20mL变性琼脂糖凝胶(1%)      5×电泳缓冲液 4mL   +    琼脂糖0.2g    +    0.1%DEPC水  12.6mL 加热溶解,稍冷却,加入3.4mL 37%甲醛 
 
 
【实验步骤】
 
1.总RNA提取 
(本实验对实验器皿要求非常严格。 RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类。除细胞内源RNA酶外,外界环境中灰尘、器皿、试剂、汗液、唾液中均存在RNA酶。各种器皿试剂都很容易被污染。这类酶耐热、耐碱、耐酸,煮沸15min也不能使之完全失活。操作时应戴手套。RNA操作中的器皿应该用DEPC处理,操作如下:将器皿浸泡于0.1%DEPC溶液中12小时,121℃高压灭菌15min,再70~80℃烘干)
 
(1)在50mL离心管中加4ml 4mo1/L异硫氰酸胍变性液,并将离心管放于冰浴中5 min。
(2)在上述管中加入1g新鲜的小鸡肝组织,匀浆粉碎。
(3)向离心管中加入:  
 苯酚3mL    2mol/L NaAc(pH4.8) 0.3mL   氯仿 0.6mL 颠倒混匀(不要剧烈),冰浴放置30min(破坏细胞结构,抑制RNA酶活性)。
(4)4℃,8000r/min,离心13min。
(5)将上清移入到另一干净无菌离心管中。
(6)加入2倍体积无水乙醇,-20℃,1h。
(7)4℃,8000r/min,离心13min。
(8)弃上清,在沉淀中加入1mL 4mo1/L LiCl,使RNA溶解。
(9)移入1.5mL 离心管中,冰浴2小时。
(10)13000r/min,离心15min。
(11)弃上清,在沉淀中加入400μL水(经DEPC处理),再加入400μL氯仿,混匀(去蛋白)。
(12)13000r/min,离心6min。
(13)取上清,并加入1/10体积3mo1/L NaAc(pH5.0),2倍体积无水乙醇,-20℃放置30min。
(14)13000r/min,离心13min。 
(15)将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次(70%乙醇用DEPC水配制)。
(16)将沉淀RNA室温下稍干燥。 
(17)加100μL DEPC水溶解,-20保存℃。
 
 2.甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA 
(1)配制1%变性琼脂糖胶称取0.2g琼脂糖,加入DEPC水12.6mL,5×电泳缓冲液4mL,EB 1μL,加热使溶解。稍冷却加入37%甲醛3.4 mL,混匀,室温凝固0.5~1h(通风橱操作)。 
(2)点样。 
(3)50V恒压电泳,至溴酚蓝移至前沿1cm处停止电泳。 
(4)取出凝胶,在紫外光下观察结果,并拍照做记录。
 
 
【实验结果】
 
在紫外光下可以看到18S rRNA和28S rRNA两条带,走在前面的是18S rRNA。
 
 
【实验安排】
 
本实验从提取RNA到电泳检测一天内完成,但需提前做准备,如器皿的处理等。
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