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蛋白酶酶活的测定方法(福林法)

1. 酶单位定义:  1g固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和pH值条件下,1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位,以u /g(u/mL)表示。

2.原理
蛋白酶在一定温度和pH值条件下,水解酪素底物,产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生成钼蓝和钨蓝,用分光光度法测定,计算其酶活力。

3.试剂和溶液
3.1福林试剂的准备
于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g,水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL,小火沸腾回流10h,取下回流冷却器,在通风橱中加入硫酸锂(LiSO4)50g,水50mL和数滴浓溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷却后仍有绿色需要再加入溴水,再煮沸除去过量的溴),冷却,加水定容至1000mL,混匀,过滤。制得得试剂应呈金黄色,贮存于棕色瓶内。
使用溶液:一份福林试剂与二份水混合,摇匀。

3.2碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L
    称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,加水溶解并定容至1000mL。

3.3三氯乙酸c(CCl3.COOH)=0.4mol/L
    称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。

3.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L
    按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c(HCl)=1mol/L及0.1 mol/L
按GB601配制。

3.6 缓冲溶液
a.磷酸缓冲液(pH=7.5),适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4. 2H2O0.5g,加水溶解并定容至1000mL
b.乳酸缓冲液(pH=3.0),适用于酸性蛋白酶
甲液  称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000mL。
乙液  称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液 取甲液8mL,乙液1mL,混匀,稀释一倍,即成0.05mol/l乳酸缓冲溶液。

c.硼酸缓冲溶液(pH=10.5),适用于碱性蛋白酶。
甲液  称取硼酸钠(硼砂)19.08g,加水溶解并定容至1000mL。
乙液  称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液 取甲液500mL,乙液400mL,混匀,用水稀释至1000mL。

3.7 10g/l酪素溶液
    称取酪素10.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后,加入适量得各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入1000mL容量瓶,用适宜的pH值的缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。

3.8 100μg/mL L-酪氨酸标准溶液
a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,准确至0.0002g,用1 mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/l盐酸定容至100mL,即得100μg/mL L-酪氨酸标准溶液。

4仪器和设备
4.1 恒温水浴  40℃±0.2℃。
4.2分光光度计  应符合GB9721的规定。

5 分析步骤
5.1 标准曲线的绘制

a.L-酪氨酸标准溶液:按表A3配制。
表A3
管号 酪氨酸标准溶液的浓度
μg/mL
取100μg/mL酪氨酸标准溶液的体积    mL 取水的体积
mL
0 0 0 10
1 10 1 9
2 20 2 8
3 30 3 7
4 40 4 6
5 50 5 5

b.分别取上述溶液各1.00mL(须做平行试验),各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL,福林试剂使用液1.00mL,置于40℃±0.2℃水浴中显色20min,用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿,以不含酪氨酸的0管为空白,分别测定其吸光度,以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度C为横坐标,绘制标准曲线(曲线应通过零点)。
根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),既为吸光度常数K值。其K值应在95~100范围内。

5.2 测定
(1)待测酶液的制备
a.称取酶粉1~2g,精确至0.0002g(或取液体酶1.00mL),用少量该酶的缓冲液溶解,并用玻璃棒搅拌捣研,将上清液小心倾入容量瓶中,沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲溶液定容至刻度,摇匀。通过四层纱布过滤,滤液根据酶活力再用一次缓冲液稀释至适当浓度,供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25~0.40范围内)。

b.酶粉测定时,稀释倍数参考表4(液体酶液可参照表4稀释)。
 
 
表4
酶活单位 总倍数 第一次稀释 第二次稀释
2万 2000 2g—200mL(100倍) 5mL—100mL(20倍)
3万 2500 2g—500mL(250倍) 5mL—50mL(10倍)
4万 4000 2g—200mL(100倍) 5mL—200mL(40倍)
5万
8、10万
5000
10000
2g—500mL(250倍)
2g—500mL(250倍)
5mL—100mL(20倍)
5mL—200mL(40倍)
 
(2)测定
a 先将酪素溶液放入40℃±0.2℃恒温水浴中,预热5min。
b 按下列程序操作
于660nm波长,用10mm比色皿测其吸光度
c. 1.398和166蛋白酶,除反应与显色温度为30±0.2℃外,其他操作同5.2,标准曲线也作同样处理。

5.3 计算X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n
式中,X—样品的酶活力,u /g(u/mL);
A样品平行试验的平均吸光度;
K—吸光常数 (K=97.09实验室测定值)
4—反应试剂的总体积,mL;
10—反应时间10min,以1min计;
n稀释倍数

5.4 结果的允许差
平行试验相对误差不得超过3%。
 
 
需要准备的:麸皮,面粉,水,纱布,福林试剂,250ml三角瓶,每组10-15支试管,分光光度计,三氯乙酸,磷酸缓冲液或水,碳酸钠溶液,酪素,已传代好的试管斜面。
最好能镜检一下真菌菌丝的形态。

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