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质粒的制备


来源:生物在线

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要
载体,它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 
质粒的提取方法很多,大多包括3个主要步骤:细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例,介绍质粒的抽提过程。 

实验目的:掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各
试剂的作用。 
实验材料:含有质粒pUC18
载体的大肠杆菌菌液,克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。 
实验原理:在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中,细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 
实验步骤: 
1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养; 
2.用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有Amp抗生素的LB培养基中,37℃摇床~250 r/min过夜培养; 
3.吸取1.5 ml菌液,12000 g离心2分钟,收集菌体,倒掉菌液;吸取1.5 ml菌液,再次收集菌体,尽量将菌液倒干净; 
4.加入300 ml溶液 I振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意:应彻底打匀沉淀或碎块); 
5.加入300 ml溶液II,轻柔颠倒混匀,放置至清亮,一般不超过5分钟; 
6.加入300 ml溶液III颠倒混匀,放置于冰上10分钟,使杂质充分沉淀; 
7.12000 g离心10分钟; 
8.吸取800 ml上清液(注意:不要吸取到飘浮的杂质)至另一Eppendorf管中,加入2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟; 
9.12000 g 常温离心15分钟; 
10.倒尽上清,加75%乙醇浸洗除盐(放置片刻或离心3分钟后倒去上清); 
11.室温放置或超净台上风干DNA; 
12.加40 ml灭菌超纯水或TE溶解; 
13.质粒、BAC的质量检测,于-20℃保存。 

附注:质粒检测 
电泳检测:质粒电泳一般有三条带。 
吸光值检测:采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值,若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7-1.9之间,说明质粒质量较好,1.8为最佳,低于1.8说明有蛋白质污染,大于1.8说明有RNA污染。
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