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质粒转化大肠杆菌
 


该实验主要有两个用途:
1.重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后,通常会发生质粒的重组失败,包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选,把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因,一旦重组成功,质粒环化(包括自身环化),抗生素抗性基因表达,被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力,可以含该抗生素的培养基中生长传代,不然,重组失败,大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。
2.为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快,在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟,而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝,因此,通过对转化成功的大肠杆菌培养,可以在短时内极大地扩增目的质粒。(作为分子生物学用大肠杆菌,是经过实验室改造过的工程菌。)

 
原    理
本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理,制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重组质粒,产生5×106~2×107 个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后,质粒粘附在大肠杆菌的表面,在42℃的温度时,大肠杆菌出现热休克,质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后,加入LB培养液,于37℃振动培养可使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性基因,提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代,形成菌落。
 

实验准备

一.器材
天平、秤量匙、秤量皿
加热磁力搅拌器、搅拌子
可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头
经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架
定时器、记号笔、一次性手套和筒纸
42℃恒温水浴
4℃和-70℃冰箱
煤气灯或酒精灯
恒温培养摇床(调至37℃,225rpm)
37℃培养箱
玻璃涂棒(普通玻璃吸管,细头部在煤气灯上烧成“L”形)
消毒过的洁净培养皿(直径10cm)

二.试剂
1.  LB培养基
细菌培养用胰化蛋白胨        10g
细菌培养用酵母提取物          5g
NaCl                                       5g     
加800ml水,放入磁力搅拌棒,在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解,用5M NaOH(约0.2 ml)调节pH值至7.0,加水定容至1000 ml。高压15 lbf/in2(1.034×105pa)消毒30分钟,冷却后可加入氨苄青霉素(50mg/ml)500ul,视载体特性而定,混匀,即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。
2.  含有琼脂的培养基
即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂。
3.  抗生素琼脂平板
4   待含有琼脂的培养基冷却后,加入抗生素,倾入培养皿,约30~50 ml,用煤气灯火焰掠过培养基表面,以消除气泡。冷却后,标记,封于塑料袋中,倒置,于4℃冰箱内避光保存。
5.  pH试纸(或pH计)

三.实验材料
来源于实验一的重组质粒
受感态大肠杆菌
碎冰及碎冰保温盛器
 
                        
实验步骤

1.    自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌,插入湿冰中溶解约15分钟,轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管,并立刻将细菌放回-70℃冰箱。
细菌                    50 ul
DNA                    5 ul        
2.    轻轻混匀,静置冰上30分钟。
3.    于42℃水浴中热休克细菌45秒,迅速移入湿冰中,静置2分钟,加入900ul LB培养液,放入37℃恒温箱摇床,225rpm摇晃培养1小时。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上,待干燥后,倒置,存放于37℃的培养箱中过夜。
4.    次日,检查各培养皿中是否出现菌落。
 
实验结果
转化成功,培养皿中可见散在的菌落。
转化失败,培养皿上无菌落,或菌落布满如苔样,后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。

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