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第一节 概 述

  从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统,目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。

  一、RNA制备

  模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换(使用一次性手套)。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。

  细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、cDNA第一链的合成

  所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。

  AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。

  三、cDNA第二链的合成

  cDNA第二链的合成方法有以下几种:

  (1) 自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应,而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。

  (2) 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。

  四、cDNA的分子克隆

  已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Li
nker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。

第二节 动植物组织mRNA提取

  一、材料

  水稻叶片或小鼠肝组织。

  二、设备

  研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽。

  三、试剂

  1、无RNA酶灭菌水:用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃ 2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。

  2、75%乙醇:用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱

        3、1×层析柱加样缓冲液;20mmol/L Tris·Cl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS。

  4、洗脱缓冲液:10mmol/L Tris·Cl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS。

  四、操作步骤

  (一)动植物总RNA提取-Trizol法

  Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。

  1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

  2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。

  3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。

  4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。

  5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

  [注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。

  2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。

  (二)mRNA提取

  由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT) 纤维素柱,可得到较纯的mRNA。

  1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

  2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

  3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。

  4、将(一)中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

  5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

  6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。

  7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2), 2.5倍体积的冰冷乙醇, 混匀, -20℃30分钟。

  8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗 涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。

  9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。

  10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。

  [注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

  2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

第三节 植物病毒RNA提取

  大多植物病毒RNA为单链RNA,并且其极性与mRNA极性相同,植物病毒RNA提取较为简单,一般使用酚氯仿即可获得满意结果。

  一、材料

  提纯TMV病毒液(10mg/ml)。

  二、设备

  冷冻台式离心机,低温真空干燥仪,电泳仪,电泳槽。

  三、试剂

  TE-饱和酚:氯仿(1:1),氯仿,3M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE缓冲液,无RNA酶的双菌水。
  

       四、操作步骤

  1、取一eppendorf管加入提纯TMV(10mg/ml)400ml,再加入等体积酚/氯仿,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4℃下12000g离心10分钟。

  2、吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。

  3、吸取水相于新eppendorf心管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4℃下12000g离心10分钟。

  4、取水相,加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。

  5、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。

  6、小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。

  7、取10ml进行电泳分析,另10ml用于cDNA合成。

  [注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。

            2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面,因此要充分剥去病毒外壳蛋白,一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。

第四节 cDNA合成技术

  一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA合成技术

  RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统 的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括:
  20μg 特异性引物
  200μl M-MLV第一链缓冲液(5×),配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl;      15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)
  2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂
  10,000μ M-MLV反转录酶, RNase H-
5μg 对照RNA
  400μl M-MLV第二链缓冲液(10×),配方如下:
    400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
    30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
  500μ RNase H
  500μ DNA聚合酶Ⅰ
  100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ
  2×1.25ml 不含核酸酶的水
  以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

  (一) 第一链合成

  1. 试剂
  [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),EDTA (50mM和200mM),TE-饱和酚:氯仿(1:1),7.5M NH4Ac,乙醇(100%和70%),TE缓冲液。

  2. 操作步骤
  (1) 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O调整体积至15μl, 70℃处理5分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入
   5×第一链缓冲液 5μl
   rRNasin RNA酶抑制剂 25U
   M-MLV(H- )反转录酶 200U
   H2 O 调至总体积25μl

  (2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

  (3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时

  (4) 取出置于冰上

  (5) 掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。
  第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成
  注:以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA使用125μl总体积进行合成。

  (二) 第二链合成

  1、 取第一链反应液 20μl, 再依次加入
    10×第二链缓冲液 20μl
    DNA聚合酶Ⅰ 23μ
    RNase H 0.8μ
    H2O 加至终体积为100μl

  2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。

  3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA, 则需延长至3-4小时)。

  4、 掺入测定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。

       5、 cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟, 低速离心后置冰上。

  6、 加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃温浴10分钟。

  7、加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。

  8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。

  9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30分钟后离心5分钟。

  10、 小心丢去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,离心2分钟。

  11、 小心移去上清液,干燥沉淀。

  12、 沉淀溶于10-20μl TE缓冲液。

  (三)同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析

  1. 试剂

  1mg/ml鲑鱼精DNA, 三氯乙酸(TCA, 5%和7%),碱性琼脂糖胶,碱性胶电泳缓冲液,( 30mM NaOH,1mM EDTA),2×样品缓冲液,(20mM NaOH,20% 甘油,0.025%溴酚蓝)。

  2. 操作步骤

  (1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活性。

  (2) 同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡旋混合仪混合后置冰上5-30分钟。

  (3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 这些样品代表掺入放射性活性。

  (4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。

  3. 第一链产量测定

  第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%

  掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)

  设330为每mol dNTP的平均分子量

  合成cDNA量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol

  mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng)×100%

  例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA摸板量为1μg,反应体积为25μl, 则:

  掺入率=3040/254000×100%=1.2

  掺入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

  合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng

  mRNA向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%
  
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